Дитиотреитол (ДТТ) је често коришћено редукционо средство, познато и као нови зелени адитив. То је органско једињење мале молекуларне величине са две меркаптанске групе (-SH). Због својих редукционих својстава и стабилности, ДТТ се широко користи у биохемијским и молекуларно-биолошким експериментима.
Главна улога ДТТ-а је редукција дисулфидних веза у протеинима и другим биомолекулима. Дисулфидна веза је важан део савијања и стабилности протеина, али под одређеним експерименталним условима, као што су редуцибилна SDS-PAGE анализа, рекомбинација и савијање протеина, неопходно је редуковати дисулфидну везу на две тиолне групе како би се разоткрила просторна структура протеина. ДТТ може реаговати са дисулфидним везама да би их редуковао на меркаптанске групе, чиме се отвара просторна структура протеина и олакшава његова анализа и манипулација.
ДТТ се такође може користити за заштиту активности и стабилности ензима. У неким реакцијама катализованим ензимима, активност ензима може бити смањена оксидансом. ДТТ може реаговати са оксидансима да би их редуковао на безопасне супстанце, чиме штити активност и стабилност ензима.
У поређењу са традиционалним редукционим средствима као што је β-меркаптоетанол (β-МЕ), DTT се сматра безбеднијим и стабилнијим редукционим средством. Није само стабилан у воденом раствору, већ одржава своја редукциона својства и на високој температури и у кисело-базним условима.
Употреба DTT-а је релативно једноставна. Генерално, DTT се раствара у одговарајућем пуферу, а затим додаје у експериментални систем. Оптимална концентрација DTT-а мора се одредити у складу са специфичним експериментом и генерално се користи у опсегу од 0,1-1 mM. Ниже концентрације могу смањити негативне ефекте на раст ћелија и могу смањити цитотоксичност услед прекомерне експресије циљних протеина. Веће концентрације могу изазвати прекомерно метаболичко оптерећење ћелија, што утиче на раст ћелија и ефикасност експресије.
Начин за одређивање оптималне концентрације може бити процена нивоа експресије циљног протеина спровођењем IPTG индукционих тестова при различитим концентрацијама. Тестови културе малог обима могу се извести коришћењем низа IPTG концентрација (нпр. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, итд.) и ефекат експресије при различитим концентрацијама може се проценити детекцијом нивоа експресије циљног протеина (нпр. Western blot или флуоресцентна детекција). Према експерименталним резултатима, концентрација са најбољим ефектом експресије је одабрана као оптимална концентрација.
Поред тога, можете се позвати и на релевантну литературу или искуство других лабораторија како бисте разумели уобичајено коришћени опсег концентрације IPTG-а под сличним експерименталним условима, а затим га оптимизовати и прилагодити према експерименталним потребама.
Важно је напоменути да оптимална концентрација може да варира у зависности од различитих система експресије, циљних протеина и експерименталних услова, тако да је најбоље оптимизовати од случаја до случаја.
Укратко, ДТТ је често коришћено редукционо средство које се може користити за редукцију дисулфидних веза у протеинима и другим биомолекулима и за заштиту активности и стабилности ензима. Широко се користи у биохемијским и молекуларно-биолошким експериментима.
Време објаве: 28. септембар 2023.