ИПТГ (изопропил-β-Д-тиогалактозид) је аналог супстрата β-галактозидазе, који је веома индуцибилан.Под индукцијом ИПТГ, индуктор може формирати комплекс са репресорским протеином, тако да се конформација репресорског протеина мења, тако да се не може комбиновати са циљним геном, а циљни ген се ефикасно експресује.Дакле, како треба одредити концентрацију ИПТГ-а током експеримента?Да ли што је веће то боље?
Прво, хајде да разумемо принцип индукције ИПТГ: лактозни оперон (елемент) Е. цоли садржи три структурна гена, З,И и А, који кодирају β-галактозидазу, пермеазу и ацетилтрансферазу, респективно.лацЗ хидролизује лактозу у глукозу и галактозу, или у ало-лактозу;лацИ дозвољава лактози у окружењу да прође кроз ћелијску мембрану и уђе у ћелију;лацА преноси ацетил групу са ацетил-ЦоА на β-галактозид, што укључује уклањање токсичног ефекта.Поред тога, постоји оперативна секвенца О, почетна секвенца П и регулаторни ген И. И генски код је репресорски протеин који се може везати за позицију О операторске секвенце, тако да је оперон (мета) потиснут и искључен.Такође постоји место везивања за катаболички ген активатор протеин-ЦАП везујуће место узводно од иницијалне секвенце П. П секвенца, О секвенца и место везивања ЦАП заједно чине регулаторни регион лац оперона.Кодирајући гени три ензима су регулисани истим регулаторним регионом да би се постигла координирана експресија генских производа.
У недостатку лактозе, лац оперон (мета) је у стању репресије.У овом тренутку, лац репресор експримиран И секвенцом под контролом секвенце промотора ПИ се везује за О секвенцу, која спречава везивање РНК полимеразе за П секвенцу и инхибира иницијацију транскрипције;када је лактоза присутна, лац оперон (мета) се може индуковати. У овом оперонском (мета) систему, прави индуктор није сама лактоза.Лактоза улази у ћелију и катализује је β-галактозидаза да би се претворила у алолактозу.Овај други, као молекул индуктора, везује се за протеин репресора и мења конформацију протеина, што доводи до дисоцијације протеина репресора из О секвенце и транскрипције.Изопропилтиогалактозид (ИПТГ) има исти ефекат као алолактоза.То је веома моћан индуктор, који се не метаболише бактеријама и веома је стабилан, па се широко користи у лабораторијама.
Како одредити оптималну концентрацију ИПТГ?Узмимо Е. цоли као пример.
Генетски модификован сој Е. цоли БЛ21 који садржи позитивни рекомбинантни пГЕКС (ЦГРП/мсЦТ) је инокулисан у ЛБ течни медијум који садржи 50 μг·мЛ-1 Амп, и култивисан преко ноћи на 37°Ц.Горња култура је инокулисана у 10 боца са 50 мЛ свежег ЛБ течног медијума који садржи 50 μг·мЛ-1 Амп у односу 1:100 за експанзиону културу, а када је вредност ОД600 била 0,6 ~ 0,8, ИПТГ је додат у финалну концентрацију.То је 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммол·Л-1.Након индукције на истој температури и у исто време, из њега је узето 1 мЛ бактеријског раствора, а бактеријске ћелије су сакупљене центрифугирањем и подвргнуте СДС-ПАГЕ да би се анализирао утицај различитих концентрација ИПТГ на експресију протеина, а затим изаберите концентрацију ИПТГ са највећом експресијом протеина.
Након експеримената, утврдиће се да концентрација ИПТГ-а није што је могуће већа.То је зато што ИПТГ има одређену токсичност за бактерије.Прекорачење концентрације ће такође убити ћелију;и уопштено говорећи, надамо се да што је растворљивији протеин изражен у ћелији, то боље, али у многим случајевима када је концентрација ИПТГ превисока, формираће се велика количина инклузије.Тело, али се количина растворљивих протеина смањила.Стога, најпогоднија концентрација ИПТГ често није већа, то боља, већ што је концентрација нижа.
Сврха индукције и култивације генетски модификованих сојева је повећање приноса циљног протеина и смањење трошкова.На експресију циљног гена не утичу само сопствени фактори соја и експресиони плазмид, већ и други спољни услови, као што су концентрација индуктора, температура индукције и време индукције.Стога, генерално, пре него што се непознати протеин експресује и пречисти, најбоље је проучити време индукције, температуру и концентрацију ИПТГ-а како би се изабрали одговарајући услови и добили најбољи експериментални резултати.
Време поста: 31.12.2021