ИПТГ (изопропил-β-Д-тиогалактозид) је аналог β-галактозидазног супстрата, који је високо индуцибилан. Под индукцијом ИПТГ-а, индуктор може формирати комплекс са репресорским протеином, тако да се конформација репресорског протеина мења, тако да се не може комбиновати са циљним геном, а циљни ген се ефикасно експресује. Дакле, како треба одредити концентрацију ИПТГ-а током експеримента? Да ли је већа то боља?
Прво, хајде да разумемо принцип индукције IPTG-а: Лактозни оперон (елемент) E. coli садржи три структурна гена, Z, Y и A, који кодирају β-галактозидазу, пермеазу и ацетилтрансферазу, респективно. lacZ хидролизује лактозу у глукозу и галактозу, или у ало-лактозу; lacY омогућава лактози из околине да прође кроз ћелијску мембрану и уђе у ћелију; lacA преноси ацетил групу са ацетил-CoA на β-галактозид, што подразумева уклањање токсичног ефекта. Поред тога, постоји оперативна секвенца O, почетна секвенца P и регулаторни ген I. Генски код I је репресорски протеин који се може везати за позицију O операторске секвенце, тако да је оперон (meta) репресован и искључен. Постоји и место везивања за место везивања катаболичког активаторског протеина гена - CAP узводно од иницијаторске секвенце P. P секвенца, O секвенца и место везивања CAP заједно чине регулаторни регион lac оперона. Кодирајући гени три ензима су регулисани истим регулаторним регионом како би се постигла координирана експресија генских производа.
У одсуству лактозе, lac оперон (мета) је у стању репресије. У овом тренутку, lac репресор који експресује I секвенца под контролом PI промоторске секвенце везује се за O секвенцу, што спречава везивање РНК полимеразе за P секвенцу и инхибира иницијацију транскрипције; када је присутна лактоза, lac оперон (мета) може бити индукован. У овом оперонском (мета) систему, прави индуктор није сама лактоза. Лактоза улази у ћелију и катализује је β-галактозидаза да би се претворила у алолактозу. Потоња, као молекул индуктора, везује се за репресорски протеин и мења конформацију протеина, што доводи до дисоцијације репресорског протеина од O секвенце и транскрипције. Изопропилтиогалактозид (IPTG) има исти ефекат као алолактоза. То је веома моћан индуктор, који бактерије не метаболишу и веома је стабилан, па се широко користи у лабораторијама.
Како одредити оптималну концентрацију IPTG-а? Узмимо за пример E. coli.
Генетски модификовани сој E. coli BL21 који садржи позитивни рекомбинантни pGEX (CGRP/msCT) инокулиран је у LB течни медијум који садржи 50μg·mL-1 Amp и култивисан преко ноћи на 37°C. Горе наведена култура је инокулирана у 10 бочица од 50mL свежег LB течног медијума који садржи 50μg·mL-1 Amp у односу 1:100 за експанзиону културу, а када је вредност OD600 била 0,6~0,8, додат је IPTG до коначне концентрације. Она је 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1. Након индукције на истој температури и у исто време, из њега је узет 1 mL бактеријског раствора, а бактеријске ћелије су сакупљене центрифугирањем и подвргнуте SDS-PAGE ради анализе утицаја различитих концентрација IPTG на експресију протеина, а затим је одабрана концентрација IPTG са највећом експресијом протеина.
Након експеримената, показаће се да концентрација IPTG-а није што је могуће већа. То је зато што IPTG има одређену токсичност за бактерије. Прекорачење концентрације ће такође убити ћелију; и генерално говорећи, надамо се да што је више растворљивог протеина експримирано у ћелији, то боље, али у многим случајевима када је концентрација IPTG-а превисока, формираће се велика количина инклузија. Тело, али количина растворљивог протеина се смањује. Стога, најпогоднија концентрација IPTG-а често није што већа то боља, већ што је концентрација нижа.
Сврха индукције и култивације генетски модификованих сојева је повећање приноса циљног протеина и смањење трошкова. На експресију циљног гена не утичу само сопствени фактори соја и експресиони плазмид, већ и други спољашњи услови, као што су концентрација индуктора, температура индукције и време индукције. Стога је, генерално, пре него што се непознати протеин експресује и пречисти, најбоље проучити време индукције, температуру и концентрацију IPTG-а како би се одабрали одговарајући услови и добили најбољи експериментални резултати.
Време објаве: 31. децембар 2021.