Око нас има много неопеваних хероја, који делују обично, али у ствари нам тихо много доприносе. Протеиназа К је „неопевани херој“ у индустрији молекуларне дијагностике, иако је у поређењу са „великим и моћним“ у индустрији, протеиназа К толико неупадљива да смо дуго превиђали њен значај. Са избијањем нове епидемије короне, потражња за протеиназом К је нагло порасла, а понуда у земљи и иностранству далеко заостаје за потрошњом, и сви су изненада схватили колико је протеиназа К толико важна.
Која је употреба протеиназе К?
Протеиназа К је серинска протеаза са протеолитичком ензимском активношћу и може одржати активност у широком спектру окружења (pH (4-12,5), пуфер са високим садржајем соли, висока температура од 70°C, итд.). Поред тога, активност протеиназе К не инхибирају SDS, уреа, EDTA, гванидин хидрохлорид, гванидин изотиоцијанат, итд., а одређена количина детерџента такође може појачати активност протеиназе К. Протеиназа К се користи у медицинском третману (дезинфекција вирусима и микробима), храни (омекшавање меса), кожи (омекшавање косе), производњи вина (бистрење алкохола), припреми аминокиселина (деградирано перје), екстракцији нуклеинских киселина, in situ хибридизацији, итд. Постоје примене протеиназе К. Најчешће коришћена примена је екстракција нуклеинских киселина.
Протеиназа К може ензимолизовати све врсте протеина у узорку, укључујући и оне хистоне који су чврсто везани за нуклеинске киселине, тако да се нуклеинске киселине могу ослободити из узорка и унети у екстракт, олакшавајући следећи корак екстракције и пречишћавања. У детекцији вирусне нуклеинске киселине, протеиназа К је једна од важних компоненти у раствору за узорковање вируса. Протеиназа К може разградити и инактивирати протеин омотача вируса, што је безбедније током фазе транспорта и детекције; поред тога, протеиназа К може и да разгради РНазу која спречава разградњу вирусне РНК и олакшава детекцију нуклеинских киселина.
Преко ноћи слава протеиназе К
Било да је у питању област научних истраживања или област ин витро дијагнозе, екстракција нуклеинских киселина је најосновнији експеримент, тако да је протеиназа К увек била веома важна. Међутим, у прошлости је протеиназа К била далеко мање позната од своје улоге. Велики део тога је био зато што је однос понуде и потражње протеиназе К био веома стабилан. Мало људи би помислило да би снабдевање протеиназом К могло бити проблем.
Са избијањем нове епидемије короне, потражња за тестирањем нуклеинских киселина је нагло порасла. Крајем јуна 2020. године, Кина је завршила скоро 90 милиона нових тестова короне, а овај број је још алармантнији на глобалном нивоу. У експериментима екстракције нуклеинских киселина, радна концентрација протеиназе К је око 50-200 μг/мл. Генерално, потребно је око 100 μг протеиназе К да би се екстраховао узорак нуклеинске киселине. У стварној употреби, како би се повећала ефикасност екстракције нуклеинских киселина, протеиназа К се често користи у повећаним количинама. Детекција нуклеинских киселина новог коронавируса довела је до велике потражње за протеиназом К. Првобитна равнотежа понуде и потражње протеиназе К је брзо нарушена, а протеиназа К је преко ноћи постала важан материјал за превенцију епидемије.
Тешкоће у производњи протеиназе К
Иако су са развојем епидемије људи ценили важну вредност протеиназе К, срамотно је што је због претерано ниске употребе протеиназе К, мало домаћих компанија било укључено у производњу протеиназе К. Када људи желе да успоставе производњу протеиназе К. Током процеса производње, откривено је да је протеиназа К изузетно посебан протеин. Изузетно је изазовно проширити производни капацитет протеиназе К у кратком временском периоду.
Производња протеиназе К у великим размерама суочава се са следећим потешкоћама
1. Ниска експресија
Протеиназа К може неспецифично разградити већину протеина и изазвати озбиљну токсичност за ћелију домаћина у којој се експресује. Стога је ниво експресије протеиназе К генерално веома низак. Скрининг експресионих система и сојева који високо експресују протеиназу К генерално захтева дужи циклус.
2. Остаци пигмената и нуклеинских киселина
Ферментација великих размера уноси велику количину пигмента и остатака нуклеинских киселина домаћина. Тешко је уклонити ове нечистоће једноставним поступком пречишћавања, а сложено пречишћавање повећава трошкове и смањује стопу опоравка.
3. Нестабилност
Протеиназа К није довољно стабилна, може се сама ензимизовати и тешко ју је стабилно чувати на 37°C дуже време без заштитног средства.
4. Лако се таложи
Приликом припреме лиофилизованог праха протеиназе К, како би се осигурао велики садржај чврсте материје протеиназе К у лиофилизованом праху, потребно је додати лиофилизовано заштитно средство у високој концентрацији, али када концентрација протеиназе К достигне 20 мг/мл и више, лако се агрегира и формира талог, што ствара велике потешкоће код лиофилизованог праха протеиназе К са високим садржајем чврсте материје.
5. Велика инвестиција
Протеиназа К има јаку протеазну активност и може хидролизовати друге протеазе у лабораторији. Стога, протеиназа К захтева специјализоване производне просторе, опрему и особље за истраживање, развој и производњу.
Раствор протеиназе К компаније XD BIOCHEM
XD BIOCHEM поседује зрелу платформу за експресију и пречишћавање протеина и има богато искуство у експресији и пречишћавању рекомбинантних протеина и оптимизацији производних процеса. Брзим формирањем истраживачког и развојног тима, превазиђен је процес производње протеиназе К великих размера. Месечна производња лиофилизованог праха је већа од 30 кг. Производ има стабилне перформансе, високу специфичну активност ензима и не садржи остатке цитохрома домаћина и нуклеинских киселина. Добродошли у контакт са XD BIOCHEM. Набавите пробни пакет (е-пошта:sales@xdbiochem.comТел: +86 513 81163739).
Техничка решења компаније XD BIOCHEM укључују
Коришћењем интеграције плазмида са више копија, одабрани су сојеви са високом експресијом и нивоом експресије од 8 г/Л, што превазилази проблем ниског нивоа експресије протеиназе К.
Успостављањем вишестепеног процеса пречишћавања, остаци цитохрома домаћина и нуклеинских киселина протеиназе К успешно су уклоњени испод стандардне вредности.
Кроз високопропусни скрининг формулација заштитних пуфера, одабран је пуфер који може стабилно да складишти протеиназу К на 37°C.
Пуфери за скрининг превазилазе проблем да се протеиназа К лако агрегира и таложи при високим концентрацијама и постављају темеље за лиофилизацију протеиназе К са високим садржајем чврстих материја.
Узорак XD BIOCHEM протеиназе К
Тест стабилности протеиназе К XD BIOCHEM: неће бити значајне промене активности након 80 дана на собној температури
XD BIOCHEM тест стабилности протеиназе К: неће бити значајне промене активности након 80 дана на собној температури.
Поређење ефекта екстракције нуклеинских киселина XD BIOCHEM протеиназе К и конкурентских производа. У процесу екстракције нуклеинских киселина користе се XD BIOCHEM и конкурентска протеиназа К, респективно. Ефикасност екстракције XD BIOCHEM протеиназе К је већа, а Ct вредност циљног гена је нижа.
Време објаве: 31. децембар 2021.